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这些抗Arf 6-GTP单克l隆抗l体还可用于通过免l疫组织化学监测细胞和组织中Arf 6的激l活。
NewEast Biosciences Arf6激l活测定试剂盒提供了一种简单且快速的方法来监测Arf 6的激l活。每个试剂盒均提供足够的量以执行20个测定。
NewEast Biosciences Arf 6激l活检测试剂盒基于特定于配置的抗Arf 6-GTP单克l隆抗l体，Active Rac，可从细胞提取物或体外载有GTPγS的Arf 6激l活检测方法来测量活性Arf 6-GTP水平。 简而言之，抗活性的Arf 6小鼠单克l隆抗l体将与含有Arf 6-GTP的细胞裂解液一起孵育。 然后，结合的活性Arf 6将被蛋白A / G琼脂糖拉低。 分别使用抗Arf 6兔多克l隆抗l体通过免l疫印迹分析检测沉淀的活性Arf 6。
试剂盒成分
特异性识别Cdc42活性构象的鼠单克l隆抗l体（Anti-active Cdc42， Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管装--30ul (抗l体浓度是1mg/ml)，抗l体溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的叠氮l化钠。此抗l体可以特异性识别所有脊椎动物中的Cdc42-GTP。
Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管装—400ul包含200ul Protein A/G agarose 和200ul 20%乙醇溶液。（使用时溶液需要充分混匀，再吸取）
5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶装—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0)， 750 mM NaCl， 50 mM MgCl2， 5 mM EDTA， 5% Triton X-100。
特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体（Anti-Cdc42， Rabbit Polyclonal Antibody (Catalog No.21010)）：小管装--30ul (抗l体浓度是1mg/ml)，抗l体溶于PBS（pH 7.4）并包含有 50%的甘油。
100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管装—100ul (10 mM) ，实验中0.5mL细胞裂解液使用 5ul GTPγS标记。
100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管装—100ul (100 mM) ，实验中0.5mL细胞裂解液使用5ul GDP标记。
体外用GTPγS/GDP处理蛋白以用作阳性和阴性的对照
注意：在细胞体内环境条件下大约有10%的Cdc42被激l活，而在体外用GTPγS处理大约有90%的Cdc42被激l活。
1. 准备两个离心管，每个管中各加入0.5 mL的细胞提取物（如果是纯的Cdc42蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug）。
2. 每个管中加入20ul 0.5M EDTA(终浓度即为20 mM)。
3. 一个管中加入5ul的100X GTPγS（终浓度即为100 uM）作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100X GDP（终浓度即为1 mM）作为阴性对照。
4. 将离心管置于30°C条件下反应30min并不断搅动。
5. 终止反应：将管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(终浓度即为60mM)。
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