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武汉纽斯特生物科技有限公司（d），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在中国的子公司。公司位于武汉东湖高新技术开发区光谷生物城.美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和医院等客户建立了长期稳定的合作关系，产品销往各地。
所需但未提供的材料
1.刺激的和非刺激的细胞裂解液
2.蛋白酶抑制l剂
3. 4°C管摇杆或摇床
4. 0.5 M EDTA，pH8.0
5. 1 M氯化镁
6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液
7.电泳和免l疫印迹系统
8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％
吐温20）
9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）
10. PVDF或硝l酸纤维素膜
11.二抗
12. ECL检测试剂
试剂准备
?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 就在
用法中，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
电泳和转移
1向聚丙l烯酰胺凝胶（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建议包括预染色MW标准（作为成功转入的指标步骤3）。
2按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3按照制造商的说明，将凝胶蛋白转移到PVDF或硝化纤维膜上说明。
免l疫印迹检测（所有步骤均在室温下搅拌）
1在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100%甲l醇中15次
然后在室温下干燥5分钟。
如果使用硝基纤维素，则应跳过此步骤。
2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封闭1小时
不断地搅动。
用抗Arl1单克l隆抗l体孵育，新鲜稀释1:50~1000
（取决于样品中Arl1蛋白质的含量）5%脱脂奶粉或3%
BSA/TBST，Rac1 kit，室温下持续搅拌1-2小时或4o
过夜。
3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。
4用二级抗l体（例如山羊抗鼠IgG，HRP结合物）培养膜，
在室温下，在5%脱脂奶粉或3%BSA/TBST中新鲜稀释1:1000，1小时
不断地搅动。
5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。
6使用您选择的检测方法，如ECL。
检测步骤
Ι。活性Cdc42 Pull-Down实验
1. 等分0.5-1 mL的细胞裂解物至微量离心管中。
2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。
3. 向管中加入1ul的活性Cdc42单克l隆抗l体。
4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。
5. 将管置于4°C条件下孵育1H，并轻轻的进行摇动。
6. 5000g，离心1分钟。
7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。
8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。
9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。
10. 用20ul的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。
11. 样品煮沸5min。
12. 5000g，离心10s。
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