Rac1 kit-武汉纽斯特生物公司(图)

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武汉纽斯特生物科技有限公司（d），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在中国的子公司。公司位于武汉东湖高新技术开发区光谷生物城.美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和医院等客户建立了长期稳定的合作关系，产品销往各地。

所需但未提供的材料

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑制l剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％

    吐温20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测试剂

试剂准备

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 就在

用法中，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

电泳和转移

1向聚丙l烯酰胺凝胶（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建议包括预染色MW标准（作为成功转入的指标步骤3）。

2按照制造商的说明进行SDS-PAGE。

3按照制造商的说明，将凝胶蛋白转移到PVDF或硝化纤维膜上说明。

免l疫印迹检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100%甲l醇中15次

然后在室温下干燥5分钟。

如果使用硝基纤维素，则应跳过此步骤。

2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封闭1小时

不断地搅动。

用抗Arl1单克l隆抗l体孵育，新鲜稀释1:50~1000

（取决于样品中Arl1蛋白质的含量）5%脱脂奶粉或3%

BSA/TBST，Rac1 kit，室温下持续搅拌1-2小时或4o

过夜。

3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

4用二级抗l体（例如山羊抗鼠IgG，HRP结合物）培养膜，

在室温下，在5%脱脂奶粉或3%BSA/TBST中新鲜稀释1:1000，1小时

不断地搅动。

5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

6使用您选择的检测方法，如ECL。

检测步骤

Ι。活性Cdc42 Pull-Down实验

1. 等分0.5-1 mL的细胞裂解物至微量离心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。

3. 向管中加入1ul的活性Cdc42单克l隆抗l体。

4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。

5. 将管置于4°C条件下孵育1H，并轻轻的进行摇动。

6. 5000g，离心1分钟。

7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。

9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。

11. 样品煮沸5min。

12. 5000g，离心10s。